Гистологическая техника. Методы и техника микроскопирования
Важность науки в жизни всего общества отрицать очень сложно. Учёные и их разработки дали обществу всё то, чем оно теперь пользуется с радостью и наслаждается. Разработки учёных в разных областях позволяют побеждать смертельные болезни, бороться с психическими расстройствами, создавать уникальную «умную» технику и даже роботов. Возможности науки поистине безграничны. Новые лица всегда приносят с собой новые идеи, которые становятся основой для будущих разработок. Однако множество разработок базируется на простых и проверенных методах.
Многие мудрецы прошлого говорили о том, что существует макро-, микромир. На том этапе развития люди не могли осознать всю глубину этих слов. Ведь макро- и микромир действительно существуют и очень тесно взаимодействуют. Крохотные изменения в структуре клетки могут быть вызваны глобальными изменениями в Солнечной системе. На сегодняшний день доказать или опровергнуть такую взаимосвязь очень сложно, но исследования мира бактерий и клеток говорят о том, что клетка - это маленькая Вселенная.
Микроскопия
Микроскопия - это научное при помощи микроскопа. В переводе с греческого это слово означает «маленький, небольшой». Микроскопия может подразделяться на несколько подвидов: оптическую, многофотонную, рентгеновскую, лазерную и электронную. Цель этого способа исследования заключается в увеличенном наблюдении за объектом и регистрацией замеченных изменений.
История микроскопа
В начале своего исторического развития микроскопы представляли собой которые использовали лучи видимого света. Такие приборы были очень слабы для наблюдения и подходили только для простейших операций. Идея возникновения электронного микроскопа возникла в тот момент, когда учёные задумались о замене электромагнитного излучения на электронный пучок. Это событие стало для развития электронного микроскопа, который значительно расширил возможности наблюдения за объектом.
Методы микроскопии
Для того чтобы правильно и тщательно обследовать какой-либо объект, необходимо работать по определённому алгоритму. Подобные алгоритмы вырабатываются один раз и применяются годами. Для того чтобы изучать окружающий мир при помощи специальной техники, необходимо владеть особыми методами. Методы микроскопии - это совокупность различных алгоритмов, следуя которым, можно основательно и системно изучить конкретный объект микромира. Прохождение пучка света через микроскоп сопровождается некоторыми изменениями первоначальных характеристик, которые могут быть вызваны структурным строением предмета. Этот процесс может сопровождаться рядов оптических эффектов, таких как отражение, поглощение, преломление, дисперсия и т.д.
Методы световой микроскопии
Световая микроскопия - это система методов, которые используют различные оптические эффекты для достоверного отображения результатов. Видимые элементы и характер полученного изображения будут во многом зависеть от освещения. Всего насчитывается большое количество методов микроскопии: светлого поля, косого освещения, интерференционного контраста, тёмного поля, поляризационный метод, фазово-контрастная, ультрафиолетовая, люминесцентная, инфракрасная микроскопия, конфокальный микроскоп.
Все эти методы имеют определённые достоинства и недостатки. При работе с образцом выбирать тот или иной метод следует исходя из его адекватности в данной ситуации. Сильные и слабые стороны каждого метода не важны в целом, главное, чтобы метод был применим в заданных условиях.
Микроскопия и медицина
Применение микроскопии в медицине имеет огромный потенциал. На сегодняшний день благодаря микроскопам можно исследовать различные клетки организма человека для того, чтобы точно определять состояние здоровья. Клетки организма дают наиболее точный и достоверный результат, который до недавнего времени было невозможно получить, так как микроскопы не могли дать исчерпывающей информации.
Использование таких приборов очень перспективно, ведь методы лечения и диагностики могут разительно преобразиться и вовсе перейти на новый уровень. Исследование с помощью микроскопов известно и применяется длительное время, однако наука стоит на пороге того, чтобы лечить человека клетками. Это уникальная возможность, которая позволит отойти от привычных методов лечения и забыть о лекарствах. Клетка - самый мощный элемент организма. Говорить о том, какую пользу может принести пересадка больному человеку здоровых клеток, просто бессмысленно, ведь это очевидно.
Исследование мочи
Общий анализ мочи - это комплекс мероприятий, которые направлены на исследование свойств мочи и её физико-химического состава. Важными показателями при этом являются цвет, запах, реакция, прозрачность, плотность, а также содержание в моче различных веществ. Микроскопия осадка мочи позволяет определить наличие солей, клеточных элементов и цилиндров. Следует понимать, что моча - это конечный продукт деятельности почек, который может очень точно отображать состояние обменных процессов и крови в организме.
Анализ осадка мочи
Микроскопия мочи позволяет создать более полную картину при полном обследовании организма. Также мазок часто используют для обычной и дифференциальной диагностики болезней мочевыводящих путей и почек. Во время лечения микроскопию мочи могут назначать для того, чтобы получить оценку эффективности докторского вмешательства. Исследование мочи позволяет выявить конкретные или потенциальные проблемы в водно-электролитном балансе организма, также в процессе обмена веществ. Анализ мочи весьма эффективен при диагностике на болезни желудочно-кишечного тракта, а также при инфекционных и воспалительных процессах в организме. Иногда микроскопию мочи используются для того, чтобы следить за состоянием пациента в период терапевтического или хирургического лечения.
Исследование крови под микроскопом
Кровяные тельца формируются в красном костном мозге, а затем выбрасываются в кровоток. Каждая выполняет свою определённую функцию. Лейкоциты нужны для борьбы с инфекционными клетками, эритроциты способствуют обогащению клеток кислородов и удалению из них углекислого газа, тромбоциты очень важны для гемостаза. В нормальных условиях тело человека вырабатывает нормативное значение всех клеток, которое не выходит за определённые рамки. При возникновении каких-либо осложнений или при болезни клетки крови могут менять свои размеры, форму, цвет и количество. Только благодаря точному микроскопическому исследованию можно определить состояние клеток и сделать соответствующие выводы.
Кровь - это живительная жидкость организма, которая обеспечивает обмен полезными веществами между всеми клетками. Микроскопия мазка крови - это исследование, которое производится под микроскопом. Исследуется препарат, приготовленный из одной капли крови. Эта процедура входит в общий анализ крови или лейкоцитарную формулу и отдельно не совершается.
Микроскопия мазка
Для чего нужен Микроскопия мазка крови даёт специалисту очень важные знания о состоянии здоровья человека. При помощи этого анализа можно определить количественное соотношение эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, а также их формы и размер. Кроме того, позволяет определять количественное выражение незрелых лейкоцитов, что является очень важным моментом в ряде заболеваний. Также мазок крови позволяет качественно диагностировать заболевания, которые могут быть связаны с нарушениями функций крови, её образования, свёртываемостью, а также разрушением Очень важной задачей микроскопического мазка на кровь является регулярное отслеживание состояния клеток крови, их зрелость после лучевой и химиотерапии, при проблемах с гемоглобином, а также при лейкозах.
Назначается мазок на кровь в том случае, если общий анализ крови показал, что увеличено количественное выражение лейкоцитов, незрелых или атипичных клеток. Для мазка можно использовать биоматериал из крови или капилляров.
Биология и микроскопы
Биология значительно расширяет возможности использования микроскопов. Как уже говорилось раньше, цитология во многом опирается на современные и мощные микроскопы. Микроскопия в биологии открывает для учёных невиданные просторы для опытов и исследований. Современные разработки позволяют уже сейчас говорить о том, какое будущее нас ждёт.
Микроскопия в биологии имеет очень широкое применение. Приборы позволяют исследовать организмы, которые недоступны глазу человека, но очень важны для научных экспериментов. В биологии чаще всего используют метод электронной микроскопии, который даёт изображение за счёт направленного потока электронов. При этом даже световой микроскоп позволяет исследовать живые биологические объекты.
Метод микроскопии в биологии применяется очень активно, так как практически все разновидности применимы для биологических исследований. Интерференционная микроскопия позволяет исследовать прозрачные жидкости и объекты, а также давать их качественный анализ. Это возможно благодаря тому, что луч света, проходя через прибор, раздваивается: одна его часть проходит через объект, а другая - мимо. Таким образом, два луча интерферируют и соединяются, давая полноценное изображение.
Микроскопия в разных областях применения
Область применения микроскопии очень широка. Несмотря на то что изначально микроскопы были предназначены для исследований в области биологии, на сегодняшний день сфера их влияния значительно расширилась. Микроскопия - это комплекс методов, который нашёл своё применение при анализе твёрдых и кристаллических тел, структуре и строений поверхностей. Также микроскопы активно используются в медицине не только для диагностики, но и при выполнении микрохирургических операций. Более того, известно, что учёными был разработан подводный лазерный микроскоп, цель которого состоит в поиске внеземной жизни на Европе.
Также не следует забывать о бурном развитии нанотехнологий, которые немыслимы без микроскопов. Развитие этой отрасли приводит к тому, что разновидности микроприборов постоянно совершенствуются. Более того, появляются новые которые предназначены для исследования определённой среды.
Подводя некоторые итоги, следует сказать о том, что микроскопия - это перспективная область, которая с каждым годом развивается всё более активно. Интерес к стволовым клеткам человека, а также развитие нанотехнологий ведёт к тому, что микроскопы становятся неотъемлемой частью любой исследовательской работы.
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые
микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры
не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.) a электронные для изучения
более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы
- это сложные оптические
приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой
аккуратности.
Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные
и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой.
Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед")
имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие,
Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается
цифрой.
В микроскопе различают механическую и оптическую части.
К механической части
относятся: штатив (состоящий из основания
и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления
и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления
конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого
(макромеханизм, макровинт) и тонкого
(микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть
микроскопа представлена объективами, окулярами
и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных
под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую
сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются
в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение,
устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий
один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.
Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы
1.
Источник света;
2. Коллектор;
3. Ирисовая полевая диафрагма;
4. Зеркало;
5. Ирисовая аппертурная диафрагма;
6. Конденбсор;
7. Препарат;
7". Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое; объективом;
7"". Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в
окуляре;
8. Объектив;
9. выходной значок объектива;
10. Полевая диафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Глаз.
Основную роль в получении изображения играет объектив
. Он
строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем
это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр,
который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение
микроскопа ориентировочно можно определить, умножая
увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет
качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей
способностью микроскопа
, т. е. возможностью различать раздельно две
близко расположенные точки. Предел разрешения
- минимальное
расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,- зависит от длины волны
света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая
апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя
преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом.
Угловая апертура-это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив
лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления
среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления
стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру
конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет
следующий вид:
где R - предел разрешения; - длина волны; NA - числовая апертура.
Различают полезное
и бесполезное
увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива,
увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет
новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают
«сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с
максимальной апертурой и увеличением (90-100 х). «Сухой» объектив - это такой
объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.
Особенностью иммерсионных объективов является то, что между
фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость,
имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему),
что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива.
В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют
дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии-кедровое масло или
специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического
иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно
нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной
линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра,
в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя
пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.
**Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками:
сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др.
В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной
мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают
объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в
которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и
планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое
изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных
объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения.
Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное
увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной
иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части,
объективы масляной иммерсии-обозначение МИ и черное кольцо.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе
с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами
нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина
покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива,
и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть
повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых
применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки
изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от
осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования
накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является
апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения
препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора,
коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр
освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор.
Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор,
необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.
Настройка освещения н фокусировка микроскопа
Качество изображения в значительной мере зависит также от
правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата
при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки
света по Келеру
, который заключается в следующем:
1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3)помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение
нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе;
5) убирают лист бумаги с зеркала;
6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая
патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние
осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было
равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму
можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы
осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение
препарата;
9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое
имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор,
добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости
препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают
накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы
конденсора;
11)при смене объектива необходимо проверить настройку света.
После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf
раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать
только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата.
Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному
снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению
качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности
раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус,
открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть.
Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения
(до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с сильными
сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную
линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают
объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в
окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения
и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.
Уход за микроскопом
При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия.
Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров.
Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса
от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке
внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой
в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной,
не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной
чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется
протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее
резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать
и разбирать объективы - это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе
необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы
объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор
в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать
его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой
мягкой чистой тряпкой.
Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная , темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют
в микробиологии: устройство микроскопа и основные приемы микроскопирования живых микроорганизмов
1 Особенности разных видов микроскопии
2 Устройство светлопольного микроскопа
3 Правила работы с иммерсионным объективом
4 Приемы микроскопирования живых микроорганизмов
1 Особенности разных видов микроскопии
Основными задачами микроскопии являются следующие:
Выявление микроорганизмов в различных материалах.
Ориентировочная идентификация микроорганизмов в образце.
Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).
Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.
На сегодняшний день наиболее используемой является световая микроскопия.
Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2–3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст).
Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0,2 мм. Контраст изображения – это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, изменяющие световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света – цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.
Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 40 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1 000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2 000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.
Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы. Числовая апертура – это оптический «охват» линзы, она является мерой количества света, попадающего в линзу. Числовая апертура объектива указана на его оправе. Апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива. Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом (т.е. «сухой системы»), не может превысить 1, так как показатель преломления воздуха равен 1. Числовую апертуру можно повысить, если увеличить показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом, приблизив его к показателю преломления стекла (1,5). Для этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления большим, чем показатель преломления воздуха, например, каплю воды (n = 1,3), глицерина (n = 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла (n = 1,5). Для каждой из указанных выше жидкостей выпускаются специальные объективы, которые называются иммерсионными.
Световая микроскопия включает обычную просвечивающую микроскопию (светло-, темнопольную), фазово-контрастную, люминесцентную. В последнее время разработаны и другие способы микроскопии и микроскопы – инверсионная и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. У светового микроскопа максимальная разрешающая способность составляет 0,2 мкм, что обеспечивает высокоточное увеличение микроскопа до 1500х.
Фазово-контрастная микроскопия позволяет более четко наблюдать живые прозрачные объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. Действие фазово-контрастного микроскопа основано на интерференции света в плоскости изображения, обусловленной сдвигом по фазе (при использовании фазового кольца в апертурной диафрагме). При фазово-контрастной микроскопии часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики – инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор – сверху.
С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).
Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света. При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора. Темнопольная микроскопия является очень простым, но эффективным методом и хорошо подходит для получения изображения живых и неокрашенных биологических образцов. Учитывая простоту установки, качество получаемых изображений весьма хорошее.
При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.
Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться при их освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. При использовании ультрафиолетового света разрешающая способность микроскопа может достигать 0,1 мкм.
Клетки микроорганизмов обрабатывают специальными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500–1:100 000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку. В зависимости от химического состава, клеточные структуры в разной степени адсорбируют красители и люминесцируют различным образом. Кроме того, флуорохромы неодинаково адсорбируются живыми и мертвыми клетками. Это позволяет использовать данный вид микроскопии для цитологических и иммунологических исследований, определения жизнеспособности клеток и т. д.
Электронная микроскопия позволяет обнаружить объекты, которые не разрешаются при использовании световых или ультрафиолетовых лучей. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм; реальное разрешение современных электронных микроскопов приближается к 0,1 нм. На практике разрешение для биологических объектов достигает 2 нм.
Короткая длина волны электронов позволяет различить объекты размером 0,5–1,0 нм. В современных электронных микроскопах на экране достигается увеличение 5000– 200 000. Благодаря столь высокому разрешению становится возможным выявление деталей бактериальных структур. Например, с помощью напыления солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект получил название негативного контрастирования .
Электронный микроскоп, в котором изображение формируется благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называют просвечивающим (или трансмиссионным ).
В сканирующем электронном микроскопе (растровая электронная микроскопия (РЭМ) пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое формирует изображение на светящемся экране. Для РЭМ характерны высокая разрешающая способность, большой диапазон увеличений (до 100 000 и выше), большая глубина фокусировки (~100 мкм), многообразие режимов работы. Сканирующий микроскоп дает картину поверхностей и позволяет получать трехмерное изображение.
Лазерная конфокальная микроскопия дает возможность получить отчетливое изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. Данный метод пригоден лишь для исследования самосветящихся (флуоресцентных) объектов. При сочетании с компъютерной техникой возможна пространственная реконструкция изучаемого объекта. В конфокальном лазерном сканирующем микроскопе изображения внутренних сечений формируются за счет сканирования сфокусированным лазерным пучком от разных (405, 488, 532, 635 нм) лазеров и пространственной фильтрации излучения. При использовании сканирующей микроскопии ближнего поля (СМБП) достигается высокая разрешающая способность. Наименьший размер элемента, полученного с помощью СМБП, составляет 20 нм при длине волны света 0,486 нм. В изображении контролируемого элемента отсутствуют дифракционные или интерференционные эффекты, затрудняющие определение его границ. Отличительной особенностью СМБП по сравнению с атомно-силовым микроскопом является чувствительность к оптическим характеристикам поверхности контролируемого образца, длине волны света, люминесценции и др.
Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет получить высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур; во многих случаях применяется для изучения живых клеток. Принцип действия автоматизированного интерференционного микроскопа основан на интерференции световых пучков лазерного излучения, отраженного от опорного зеркала и зеркала, на котором помещен измеряемый фазовый объект. Теоретически предельно достижимая разрешающая способность может составить в среднем 0,2 нм, практически она составляет 0,4 мкм.
Рентгеновская компьютерная томография (РКТ), позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) позволяют наблюдать объекты в обычных условиях.
Микроскопия (лат. μΙκροσ — мелкий, маленький и σκοποσ — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, рентгеновская или рентгеновская лазерная микроскопия, отличающиеся использованием электромагнитных лучей с возможностью рассмотрения и получения изображений микроэлементов вещества в зависимости от разрешающей способности приборов ().
Оптическая микроскопия. Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов.
Оптический, или световой микроскоп использует видимый свет, проходящий через прозрачные объекты, или отражённый от непрозрачных. Оптическая система из нескольких линз позволяет получить кажущееся увеличенное изображение образца. Полученное изображение можно наблюдать глазом (или обеими глазами, в бинокуляре), либо фотографировать, передавать на видеокамеру для оцифровки. В состав современного микроскопа обычно входит система подсветки, столик для перемещения объекта (препарата), наборы специальных объективов и окуляров.
Были разработаны виды микроскопов, порзволяющие существенно расширить возможности обычной оптической микроскопии:
До 1950-х годов работали преимущественно в диапазоне видимого спектра света. Глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Оптические микроскопы не могли давать разрешающей способности менее полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм). Предельное увеличение оптического микроскопа — до 2000 раз. Дальнейшее увеличение изображения нецелесообразно, так как не позволяло обнаружить дополнительных деталей структуры вешества. Отдельные частички размером приблизительно до 0,15 мкм хорошо видны при увеличении в 2000 раз. Более мелкие частицы не отражают световые лучи и не видны под микроскопом.
Совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др.) с помощью электронных микроскопов - приборов, в которых для получения увеличения изображений используют электронный пучок. Электронная микроскопиявключает также методики подготовки изучаемых объектов, обработки и анализа результирующей информации. Различают два главных направления электронной микроскопии: трансмиссионную (просвечивающую) и растровую (сканирующую), основанных на использовании соответствующих типов. Они дают качественно различную информацию об объекте исследования и часто применяются совместно. Известны также отражательная, эмиссионная, оже-электронная, лоренцова и иные виды электронной микроскопии, реализуемые, как правило, с помощью приставок к трансмиссионным и растровым электронным микроскопам.
Рентгеновская микроскопия — совокупность методов исследования микроскопического строения вещества с помощью рентгеновского излучения. В рентгеновской микроскопии используют специальные приборы — рентгеновские микроскопы. Разрешающая способность достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). Однако современный оптический микроскоп - наноскоп имеет разрешение до 3-10нм.
Рентгеновская микроскопия разделяется на:
- Отражательная микроскопия
- Проекционная микроскопия
- Электронная микроскопия
- Рентгеновская лазерная микроскопия
Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.
Светлопольная микроскопия
Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90.При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).
Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе
Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15 (рис. 1.13). Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности.
Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру
Под этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя точками препарата, при котором они еще четко различимы под микроскопом. Разрешающая способность обычных световых микроскопов с иммерсионной системой равна 0,2 мкм.
Темнопольная микроскопия
Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе (рис. 1.14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.
Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.
Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу «висячей» и «раздавленной» капли. При приготовлении препарата «раздавленная» капля исследуемый материал (бактериальную культуру в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным стеклом. Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Для приготовления «висячей» капли необходимо использовать специальные предметные стекла с углублением в центре и покровные стекла.
На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.
Фазово-контрастная микроскопия
При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива (рис. 1.15).
Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.
Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.
Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.
Люминесцентная микроскопия
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.
Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий
ультрафиолетовые лучи.
Электронная микроскопия
Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 1.17).
Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.
В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.
Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.
С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.
Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик